手把手教学|基因沉默实验:siRNA设计和转染
1、手把手教学｜基因沉默实验：siRNA设计和转染siRNA设计小干扰RNA（**all interfering RNA；siRNA）是一段长度在20-25个核苷酸之间的RNA双链，主要用于干扰RNA，达到调节基因表达（敲减）的目的。其本质是siRNA和相应的mRNA特异性结合、降解，继而实现阻滞mRNA继续翻译的目的。
2、选择适合的转染试剂至关重要，需预先与厂家沟通并参考相关文献，确保细胞类型适用。siRNA的浓度选择范围广泛，1-100nM，通过梯度实验找到最适合细胞系的浓度，这将决定转染效率、细胞毒性及基因沉默效果。转染前，细胞融合率的理想范围应在30%至60%，过高或过低可能影响转染效果。
3、siRNA转染实验是通过靶向特定基因降低或沉默其表达，进而研究基因功能的方法，主要步骤包括设计合成siRNA、细胞培养、转染、效果验证及生物学效应观察。具体步骤如下：设计siRNA 基于目标基因序列，使用在线工具（如Dharmacon、Ambion等）或委托商业实验室设计siRNA。
4、设计完毕后，输入基因编号和序列至设计网站，根据其参数设置进行siRNA设计。实验过程中，确保保持siRNA质量，避免RNA酶破坏其结构。转染时，选择合适细胞状态与浓度，以达到最佳效果。转染后，需评估siRNA效果，通常在48-72h后检测靶基因的敲低/沉默。评估方法包括qRT-PCR和western blot等。
5、实现siRNA的高效转染是验证基因功能或进行基因沉默实验成功的关键过程。以下将详细解析实验成功的关键步骤：细胞准备 细胞状态：选用生理状态良好、健康的细胞进行转染，这是提高转染效率的基础。
如何在线设计siRNA?
以下是三种常用的siRNA在线设计网站： siDirect设计网站（sidirectrnai.jp/）输入NCBI序列号或序列信息（FASTA格式），点击design siRNA。网站将提供一系列siRNA设计，包括Tm值、脱靶效应等评估信息。
选择合适的siRNA在线设计网站目前，有多个在线工具可以帮助用户设计siRNA，这些工具通常基于特定的算法和数据库，能够为用户提供高质量的siRNA设计结果。
输入CDS区域，设置条件，点击“design siRNA”。在NCBI-BLAST中进行核酸比对，验证设计的siRNA序列与目标基因的匹配程度。总结 siRNA的设计是一个复杂而精细的过程，需要综合考虑多个因素。利用在线设计网站可以大大简化这一过程，提高设计的效率和准确性。
【干货分享】如何设计siRNA
利用在线siRNA设计工具进行设计，如siDirect、DSIR、invivogen和thermofisher等网站。设计并筛选siRNA序列 将选定的靶基因序列输入到设计工具中，根据工具提供的参数和评分选择高评分的siRNA序列。结合上述设计原则，对筛选出的序列进行进一步优化和选择。
常规化学合成的siRNA，以21-23nt的双链形式提供，冻干形式的即用试剂可以稳定保存在-20℃至-80℃长达一年。使用时，需将siRNA粉末短暂离心，然后用DEPC-DW或无菌水溶解。推荐使用100pmole/μl浓度长期储存，超过2个月需置于-70°C以保持最佳效果，但需注意冻融次数不宜超过五次。
**细胞铺板**：通常在转染前一天进行，根据细胞生长速度计数后铺板，确保第二天转染时细胞密度达到80%~90%左右，以提高转染效率。 **细胞转染**：以lip2000为例，转染前更换无双抗、无血清的细胞培养基。用opti-mem稀释质粒或siRNA，同时用opti-mem稀释lip2000。